癌症诊断之MicroRNA原位杂交技术

MicroRNA in situ hybridization

for cancer diagnosis


概要


MicroRNA (miRNA)的长度约为 19-24 个核苷酸,与其碱基对与信使 RNA (mRNA) 中的互补位点配对。在“RISC”复合物的帮助下,这种结合功能可促进 mRNA 蛋白质产物的下调。MicroRNA 是癌症的重要生物标志物,因为它们参与多种生物学过程,包括发育、分化、增殖、代谢和细胞凋亡。癌症现在通过两种不同但互补的方式进行诊断,即液体活检和肿瘤组织活检。肿瘤组织活检仍然是病理学家诊断癌症的“金标准”。ISH 非常适合检测新鲜、冰冻或福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE)的“金标准”活检样本中的miRNA,因其灵敏度高、特异性强,且保留了肿瘤异质性的空间信息,而且成本相对较低。

       BioGenex的ISH系统能够产生强大的显色信号,同时保留组织样本的空间背景。这为精准的肿瘤表征提供了强大的工具,并使对于未知原发性癌症 (CUP)、低分化或未分化肿瘤以及癌症分期的临床研究和分析产生了突破性进展。


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结论

只有ISH技术才能提供肿瘤的完整空间图像,这对于帮助病理学家诊断和启动肿瘤治疗决策至关重要。

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MicroRNA(miRNA)是由Rosalind Lee和Rhonda Feinbau于1993年在哈佛大学Victor Ambrost实验室中发现的。[Lee] 当时,他们正在研究线虫秀丽隐杆线虫的发育。MicroRNA 作为一类进化上保守的小RNA,长度约为 19-24 个核苷酸,与信使 RNA(mRNA)中的位点碱基配对,靶向使这些转录本进行下调。MicroRNA 靶向全方位的细胞活动,包括发育、分化、增殖、代谢和细胞凋亡。因此,它们在传染病和癌症中发挥着重要作用。[Bhaskaran]

MicroRNA是癌症筛查、诊断(包括原发部位未知的癌症)和预后的重要生物标志物。肿瘤组织活检仍然是癌症诊断的“金标准”,原位杂交(ISH)是一种特别适合用于诊断和预后判断的miRNA检测的方法。ISH因其敏感性和特异性,特别是它可以提供的空间肿瘤异质性数据,而成为最佳选择。与其他miRNA分析技术相比,原位杂交技术可以经济有效地为病理学家提供肿瘤分级、分期和异质性评估所需的常规空间信息。



miRNA作为癌症诊断的生物标志物














      高通量测序研究表明,某些miRNA(称为oncomiRNA, 肿瘤miRNA)在癌症中经常被上调,而其他miRNA则被下调,这意味着它们有可能作为诊断和监测疾病进展的有效生物标志物。[Li J] [Wua]


      许多miRNA可以作为肿瘤抑制因子,如miR-340、miR-320a、miR-215、miR-143-5p、miR-18a。它们的抑癌潜力是从发现了肿瘤中不存在但与其匹配的对照组织中存在来定义的。根据肿瘤组织的不同,给定的 miRNA 可能既是肿瘤抑制因子又是oncomiRNA。例如,据报道,miR-215 是神经胶质瘤中的oncomiRNA, 但在非小细胞肺癌中是肿瘤抑制因子。


[Meng] [Hou]

       癌症诊断领域正朝着早期检测的方向发展,在机体系统水平上进行癌症筛查,即血液、尿液和唾液“液体活检”检测。[Wub] 血液循环中的生物标志物特别令人感兴趣,其中包括miRNA。


      从尿液中外泌体中分离的miRNA的表达特征也可以被使用。[Gheinani] 这些方法涉及癌症研究的工作流程,包括核糖核酸(RNA)的非侵入性提取和纯化。


      微阵列、PCR和高通量测序能够量化血液中循环的游离miRNA。这些循环的miRNA通常位于癌细胞衍生的囊泡内,称为外泌体。已经确定了多种实体瘤的循环miRNA特征,包括肺癌、结直肠癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌。[Zhang] [Baek] [Zhou] [Zou] [Sita-Lumsden] [Joshi] 在血液中检测到这些miRNA信号表明了癌症的存在。与上述技术相比,使用ISH技术在这种癌症组织中进行检测是更好的选择。


       循环miRNA的组成可以预测癌症对检查点免疫疗法、激酶抑制剂、化疗和放疗等治疗的反应。[Sudo] [Lin] [Baek] 这些特征也可用于预测特定癌症转移的风险。[Pi] 这些相同的特征可以通过ISH在癌症组织中确定。


       外泌体中miRNA的丰度似乎取决于从中分离它们的生物流体。从血液中分离的外泌体似乎比从尿液中分离的外泌体含有更多的miRNA。[Li M] 与mRNA 相比,血液外泌体也可能含有更多的 miRNA,使血液miRNA 成为更好的癌症生物标志物。特定miRNA(例如miR-200c)的绝对数量可能非常低,平均每个外泌体含大约一个或更少,即使从血液中分离出的外泌体也是如此。[Chevillet] 这就需要对液体活检样本采用非常灵敏的miRNA检测方法。

 

       MicroRNA也可用于使用组织活检进行传统的癌症诊断和预后。miRNA的Panels可能与肿瘤形成、肿瘤分期和分级[Nam][Zakrzewska]以及癌症患者的生存率有关。[Wong]


       外泌体可以通过与细胞融合并在细胞质内释放其内容物(包括 miRNA)来介导致癌特性,如耐药性等。人们认为癌细胞可以通过外泌体将耐药性传播到整个肿瘤中。这意味着,可能只有有限数量的肿瘤细胞可以充当耐药性外泌体工厂,释放使整个肿瘤产生耐药性的“剂量”。肿瘤细胞内外泌体miRNA的存在是该过程的标志物,这可以通过荧光原位杂交(FISH)来检测。[Zhao]


       肿瘤组织活检是准确分级肿瘤和启动患者治疗方案所需的“金标准”。液体活检的结果虽然对初步诊断有用,但可能限于预测癌症的存在,或肿瘤中存在癌症特定特性的可能性,例如对治疗的耐药性或转移能力。它们没有提供有关肿瘤异质性或其分级的信息。液体活检可以预测转移,但肿瘤的转移通常是独立分级的,也就是说转移可以早期发生,肿瘤中只有少数细胞具有转移能力。或者,转移可能发生在晚期,正如传统的癌症进展模型所预测的那样。如果没有病理学家进行直接活检和分析,原发肿瘤的分级仍然未知,而通过使用FISH技术对 miRNA 进行检测可以对此提供极大的帮助。



原位杂交方法与其他技术的比较














       微滴式数字PCR、微阵列杂交和基于RNA提取的高通量测序等技术因其灵敏度和多重能力而更适合于液体活检中miRNA的检测,然而,FISH在病理的肿瘤组织分级中独树一帜。FISH可以提供空间和低成本的细胞分布(肿瘤异质性)数据,这是微阵列或传统的高通量测序工作流程无法实现的。单细胞测序可以提供空间和细胞分布数据;然而,目前对于常规诊断使用来说,它的成本高得令人望而却步。因此,显色原位杂交 (CISH) 或 FISH 是目前最可行、最具成本效益的选择,适用于肿瘤病理医师分析来自肿瘤组织活检、新鲜、冰冻或福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 样本的定量和空间miRNA数据。


       CISH 是最经济有效的ISH,具有非常稳定的信号, 只需要基本的实验室设备, 并且使用在标准明场显微镜下观察到的非常成熟的过氧化物酶或碱性磷酸酶反应。它与FFPE、血液或骨髓涂片以及其他类型的固定细胞兼容。CISH 方法可用于评估特定 miRNA 的存在,然而,与 FISH 相比,它不适合多重检测,并且对于定义miRNA的亚细胞定位无效。缺乏多重检测能力是一个主要限制, 但对于一些诊断性miRNA检测, 单个miRNA(如miR-200c)与药物反应相关,因此CISH是一种合适的肿瘤检测方法。[Lin] 然而,大多数涉及 miRNA 的诊断检测都需要panel,而 CISH 是不够的。另一方面,FISH与多重检测高度兼容。


       FISH涉及荧光标记探针的杂交,该探针旨在与固定细胞内的特定靶DNA或感兴趣的RNA(如miRNA)杂交。含有探针的所得细胞可以通过数字显微镜或流式细胞术进行分析。对此类设备的要求使 FISH 比 CISH 更昂贵。FISH探针也会受到光漂白的影响,因此从FISH载玻片中快速捕获尽可能多的数字信息非常重要,因为它们不能无限期地存储。



使用miRNA ISH的临床优势














        原发性未知癌症 (CUP) 是从未知部位扩散的转移性肿瘤。传统上, 肿瘤是按其起源部位进行分类的, 如果原发肿瘤的位置未知, 则很难做出治疗决策。大约 3%-5% 的癌症表现为 CUP。确定原发肿瘤的位置对于手术和靶向药物干预都至关重要。原发性转移不明的患者预后不良, 生存期短。幸运的是, miRNA具有某些特性, 使其可用作识别CUP起源的诊断工具。

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      在正常组织中, miRNA表达具有高度特异性。该特性已被用于训练肿瘤起源分类器,当应用于未知转移时,用于识别肿瘤起源部位的准确率在 88-92% 之间。[Søkilde] [Pentheroudakis] 这是通过使用微阵列分析已知来源的转移来实现的。这些相同的miRNA可以通过多重FISH以更低的成本进行分析,病理学家可以此尝试鉴定CUP的原发部位。


       分化是指细胞从未分化的干细胞成为成熟的形态稳定或分化的细胞的过程。许多癌细胞具有从分化状态恢复到更像干细胞或未分化状态的特性。未分化癌症患者的预后通常较差。同样,由于miRNA表达通常具有高度的组织特异性,因此可以通过miRNA图谱与干细胞中预期的差异程度的比较来推断癌细胞去分化的程度。这有助于癌症的预后判断。一般来说,分化评分越低,预后越差。


     例如,在未分化的胃癌中,与正常胃组织相比,3个 miRNA(mir-34b、mir-34c 和 mir-128a)显著上调,3个 miRNA(mir-128b、mir-129 和 mir-148)下调。mir-20b或150高表达水平患者的生存概率显著降低,并且mir-27a与淋巴结转移之间存在相关性。[Katada] 随着更大规模研究的验证,这可能会被整合到未分化胃癌的预后算法中。


      分期是病理学家用来根据癌症在体内的扩散程度对癌症进行分类的算法。分期考虑了原发肿瘤的大小、癌症是否已经转移以及继发肿瘤的位置。每种癌症类型的分期受特定因素的影响。TNM 分期系统分为肿瘤(T)、 淋巴结受累(N)和转移扩散(M)。


      分级也是一种对癌症进行分类的算法。病理学家根据癌症的分化或干性、 倍增时间和转移的可能性对癌症进行分级, 尽管如前所述, 由于异质性, 肿瘤分级并不总是能预测肿瘤分期。


      肿瘤分期和肿瘤分级都可以通过肿瘤的miRNA谱来预测,这可以通过FISH来确定。[Pi] [Katada]


      每个解剖位置的癌症可分为不同的类型和亚型。以乳腺癌为例, 不同的类型包括导管原位癌(DCIS)、 小叶原位癌(LCIS)、 浸润性导管癌、 浸润性小叶癌、 化生性乳腺癌和炎性乳腺癌。根据癌症的分期和等级, 有时很难确定其亚型。


      由于miRNA在健康个体的某些组织中的特异性表达, 因此可以使用肿瘤内的miRNA特征来指示其起源和亚型。相应特征的检测可以通过FISH来完成。


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结论

肿瘤诊断因异质性而变得非常复杂, 肿瘤内的细胞可能彼此非常不同。这会影响分级、分期、亚型和分化状态的确定。肿瘤可以是具有不同阶段和等级的细胞的混合体。大多数分析技术(如标准PCR、微阵列和高通量测序)都忽略了癌症的这一特性, 这些技术可以给出的是肿瘤成分的平均读数。这可能不能准确反映肿瘤的真实性质。只有原位杂交技术才能提供肿瘤的完整空间图, 这对于帮助病理学家诊断和启动肿瘤治疗决策至关重要。


BioGenex miRNA癌症诊断解决方案














       BioGenex率先开发了具有领先产品的miRNA研究和诊断工具。目前,超过240种BioGenex即用型Super SensitiveTM Nucleic Acid (SSNA) miRNA ISH probes (超敏TM核酸miRNA ISH探针)可用于肿瘤的精确诊断及早期诊断。这些探针足够灵敏, 可以检测低丰度 miRNA, 这通常是生物标志物发现所必需的。它们具有高温熔融特性, 可以进行严格的洗涤以去除非特异性结合。BioGenex miRNA探针用抗荧光团进行双端标记, 以扩增信号,并产生干净的强染色。


       BioGenex 开发的 miRNA 特异性探针和原位杂交试剂盒可快速、 灵敏地检测具有高特异性的 miRNA,同时保留组织形态。每个试剂盒都包括易于遵循的实验流程和即用型试剂。由于探针的高灵敏度和特异性, 杂交试剂盒可用于手工或高通量自动化染色。BioGenex SSNA miRNA探针与Xmatrx®平台的自动化处理相结合, 通过消除容易出错的ISH程序,大大提高了检测结果的可靠性。BioGenex全自动分子病理工作站是全球最先进的系统。


       此外, BioGenex还提供 Xmatrx® MINI,这是一款紧凑、完整的玻片染色系统,用于 miRNA-ISH、CISH 和原位 PCR,可极大地优化和简化工作流程。

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       BioGenex还提供自动化解决方案,可减少劳动力并减少试剂需求。Xmatrx® NANO 是一种“高效” 微流控系统,可自动进行miRNA-ISH检测流程。这种一体化小尺寸的系统经济实惠,是 FISH 以及原位 PCR 和 CISH 检测的理想选择。对于FISH检测,科学家或病理医师只需放置载玻片,选择应用程序,在提示时添加微量试剂, 并以数字方式捕获图像。这可以将至少 33个手动步骤减少到仅6个,从而节省成本。


     BioGenex还有新型的 NanoVIP®, 为miRNA-ISH、FISH、CISH 和原位 PCR 的检测提供一个全自动系统。它可能特别适用于多重miRNA FISH。可靠的自动化与 eXACT™ 温度模块和液位传感器相结合,可实现精确的液体处理,从而保证稳定且可重复的结果。可以同时运行十种不同的检测流程,是流程优化的理想选择。NanoVIP® 可以将 33 步手动 FISH 简化为 3 个简单步骤:a)放置载玻片,b)选择流程,c)捕获图像。

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来自https://biogenex.com/microrna-in-situ-hybridization-for-cancer-diagnosis/


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